产品目录

本制品使用纳米表面生物技术将Protein A包被在超顺磁性磁珠微球表面，磁珠直径为0.2μm。磁珠表面抗体结合位点多，非特异性结合低，使用简便有效。Protein A免疫沉淀磁珠具有大面积特异的表面区域，从而大大缩短了抗体吸附和抗原结合的时间。

• 结合/洗涤缓冲液：PBST(1×PBS + 0.5% Tween-20,pH7.4)
  
• 洗脱缓冲液：0.15M Glycine,pH2.5～3.1

• 本制品pH值为6～8，禁止冻结。
  
• 本制品应避免离心、干燥或冻存，禁止长时间置于磁场，可能会引起磁珠聚团，抗体结合后操作过程应轻柔，避免抗体脱落。
  
• 为最大限度的降低蛋白质降解，推荐使用100×蛋白酶抑制剂混合物(6种)或蛋白酶抑制剂混合物片剂。
  
• 使用前请先通过查阅附录确认抗体所属亚型与Protein A的亲和度，如亲和度不佳，可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间(30-120 mins)、提高结合缓冲液的pH值(8-9)以及降低离子强度(25～100mM NaCl)等方法提高亲和效率。
  
• 为提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性，可以先将抗体与样品进行孵育，形成抗体-抗原复合物，再用Protein A磁珠捕获复合物。
  
• 磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象。在结合/洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中添加浓度为0.1% (V/V)的非离子型去垢剂(如NP-40、Tween-20或Triton X-100)可有效防止磁珠聚集。经过低pH洗脱操作的磁珠可以用结合/洗涤缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1% (V/V) Tween-20的Tris Buffer (pH7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2 mins，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。
  
• 超声处理会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，所以磁珠在捕获抗体后不宜使用该方法重悬磁珠。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 抗原样品的准备
  
  • 血清：若目标蛋白丰度较高，建议稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10～100μg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
    
  • 悬浮细胞：离心收集细胞(4℃,500g,10 mins)，弃上清后称重，按照每毫克细胞50μL的比例用1×PBS (pH7.4)洗涤2次；按每毫克细胞5～10μL的比例加入细胞裂解缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 mins；离心(4℃,14000g,10 mins)，收集上清液，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
    
  • 贴壁细胞：移去培养基，按每1×10⁵的细胞150μL的比例用1×PBS (pH7.4)洗涤2次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5mL EP管内，按每1×10⁵的细胞20～30μL的比例加入细胞裂解缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰水处理10 mins；离心(4℃,14000g,10 mins)，收集上清液，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
    
  • 大肠杆菌：离心大肠杆菌(4℃,12000g,2 mins)，弃上清后称重，按每克(湿重)菌体10mL的比例用1×PBS (pH7.4)洗涤2次；按每克(湿重)菌体5～10mL的比例加入细胞裂解缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声裂解细胞，离心(4℃,17000g,10 mins)，收集上清液，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
• 磁珠预处理
  将磁珠充分混悬，取25～50μL磁珠，置于1.5mL EP管中，加入400μL结合/洗涤缓冲液，充分混悬，置于磁力架，磁性分离，弃上清；重复以上洗涤步骤2次。
  
• 抗体与磁珠结合
  
  • 抗体预处理：使用结合/洗涤缓冲液将抗体稀释至终浓度为5～50μg/mL。
    
  • 抗体-磁珠结合：将稀释好的400μL抗体加入步骤2处理好的磁珠中，充分混悬，置于翻转混合仪孵育(常温，30 mins；4℃，2hours)，磁性分离，收集磁珠，上清液收集于新的EP管中，以备后续使用。
    
  • 洗涤：加入400μL结合/洗涤缓冲液，充分混悬磁珠，磁性分离，弃上清；重复洗涤4次。
    • 结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于在正常现象，不会影响实验结果。
• 抗原与抗体-磁珠复合物结合
  
  • 抗原-抗体-磁珠复合物结合：加入400μL步骤1准备的抗原样品，充分混悬，置于翻转混合仪孵育(常温，30 mins；4℃，2hours)，磁性分离，弃上清。
    
  • 洗涤：使用400μL结合/洗涤缓冲液充分重悬磁珠，磁性分离，弃上清；重复洗涤4次。
• 抗原洗脱
  本说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
  
  • 变性洗脱法：此方法洗脱的样品适合用于SDS-PAGE检测。
    步骤：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入25～50μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热5 mins。分离磁珠，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
    
  • 非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。
    步骤：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入25～50μL洗脱缓冲液，室温孵育10 mins；分离磁珠，收集上清至新的EP管，并立即滴入总体积1/10体积的中和缓冲液(0.1M NaOH)，将洗脱产物pH调节至中性，样品用于后期功能分析。
  • 本步骤洗脱的抗原为抗原-抗体复合物，如操作者需要单独洗脱目标抗原，推荐使用交联剂，并按相关实验说明操作。